新型智能化光学显微切削体系植物染色体切割的探讨

新型智能化光学显微切削体系植物染色体切割的探讨 文章来源：中国切割机网

　
　　染色体微切割、微克隆技术是由Scalenghe等人于1981年创立的一项分子细胞遗传学新技术。植物染色体显微切割技术就是在显微镜下，主要采用微细玻璃针或激光对特定的染色体或染色体片段进行切割、分离，然后利用切割产物为模板进行外扩增，从而构建染色体或染色体区段特异性的DNA文库，其优点是可以根据研究者的需要，分离到任意一条染色体或染色体片段，并能快速地建立相应的DNA文库。自Saudery等人利用染色体微切割和微克隆技术获得了黑麦DNA克隆以来，科学工作者已相继进行了小麦、玉米、水稻等植物的染色体微切割、微克隆技术研究。以往主要采用ACAS570UVC紫外激光扫描共焦显微系统、流式染色体分级器和玻璃针进行染色体切割、分离和收集研究，但这三种仪器设备操作复杂、技术难度大、污染较重、被分离的目标染色体难以完全回收等。而SLuCUT-A全自动激光显微切割系统切割植物染色体的应用研究在我国尚未见报道。SLuCUT-A全自动激光显微切割系统的核心技术是利用350纳米的紫外激光对显微镜下的生物样本（组织、细胞簇、单细胞、染色体、染色体片断等）进行显微切割和分离，再由载片上方的收集管带EVA膜的塑料帽逆重力将目的材料粘走，此系统具有操作简单易掌握、切割回收快速准确、样本不被降解、污染轻，整个操作过程都是通过简便易用的UVCUT软件自动完成等特点实现整套操作步骤。
　　1.1供试材料供试材料：普通小麦“中国春”种子和中间偃麦草种子（国家小麦改良中心泰安分中心保存）。
　　1.2实验仪器设备BD-255LT型低温冷冻柜；SLuCUT-A型全自动激光显微切割系统；Multiifuge1L-R型高速冷冻离心机；TP600型PCR仪；DYCZ-24B型电泳槽（梳子25齿）；DYY-12型电泳仪；TanonGis2010型凝胶成像仪。
　　1.3实验方法（1）种子发根：取普通小麦“中国春”种子和中间偃麦草在25℃无菌水中浸泡24h，然后把已露白的种子转入4℃冰箱中24h后，再置于25℃暗培养，待根长至0.5～1.5cm时，截取根尖于冰水中预处理24h（25ppm的放线菌酮20℃处理1h10min），立即移入70乙醇中于4℃保存待用。
　　（2）花粉母细胞采集与保存：取普通小麦“中国春”和中间偃麦草花粉母细胞处于减数分裂中期Ⅰ的花药，卡诺液（乙醇：冰醋酸=3：1）固定10min，立即转入70乙醇中于4℃保存待用。
　　（3）根尖和花药前低渗：用滴管缓缓滴加无菌双蒸水，并小心冲洗2次根尖（花药），4℃无菌双蒸水中前低渗3次，每次5min.
　　（4）根尖和花药酶解：切取根尖2～3mm（花药）于酶解液中（4的纤维素酶OnazukaR-10，0.5的果胶酶PectolyaseY-23，75mmol/LKCI和7.5mmol/LEDTA缓冲液配制，PH=4.0，抽滤除菌），37℃消化1h45min（花药1h）。
　　（5）根尖和花药后低渗：用滴管缓缓滴加无菌双蒸水，并小心冲洗2次根尖（花药），4℃无菌双蒸水中后低渗3次，每次5min.
　　（6）根尖和花药染色体压片：将低渗后的根尖（花药）于盖玻片上，滴1滴卡宝品红染色约5min后，轻轻捣碎根尖（花药）后反转覆盖于载玻片的PEG膜上，轻压即可，立即把压好的片子放到-20℃（至少2h），把-20℃保存的制片取出，立即用刀片揭开盖片，放入70℃烘箱干燥，-20℃保存备用。
　　（7）染色体显微切割、回收和保存：将制备好的染色体标本片翻放在载物台上，分别在10倍、20倍、40倍和100倍镜下选择目标染色体后，将黏性的Eppendorf管放在管盖固定架上，管盖固定架吸附在自动管盖提取装置上，载物台的移动、切割路径的任意勾画、切割长度的测量、聚焦、激光能量、切割速度、拍照、保存、回收等都通过简便易用的UVCUT软件来完成。切割后的染色体用黏性的Eppendorf管盖进行收集，然后加入含20μL（5ng/μL）蛋白酶K溶液（1×TaqDNA聚合酶缓冲液配制，用于DOP-PCR微扩增）的0.2mLEppendorf管中。放入37℃4h，500转/min，4min高速离心，将含有分离染色体的0.2mLEppendorf管置于37℃水浴中温浴4h，以便蛋白酶K充分消化去蛋白，然后75℃20min使蛋白酶K失活，-20℃存放备用。
　　（8）基因组DNA的提取：普通小麦“中国春”
　　和中间偃麦草DNA的提取[6].
　　（9）简并引物序列为：5‘-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’。
　　（10）DOP-PCR微量扩增条件[7].
　　轮反应：其反应体系为在含上述酶解液的Eppendorf管中，加入10×Taq酶缓冲液4μL、MgCl2（25mmol/L）3μL、2mmol/LdNTP5μL、引物（15pmol/L）5μL、Taq酶（4U/μL）0.5μL、无菌水补至50μL混匀，于BIO-RAD型扩增仪进行轮扩增；反应程序为94℃预变性10min，然后进入5个循环的94℃1min，30℃1.5min，72℃3min，其中30℃变化至72℃需3min；接着进行25个循环94℃1min，57℃1min，72℃1.5min，每圈自动延伸1s；后72℃延伸10min，4℃保温。
　　第二轮PCR反应：反应体系是轮PCR产物5μL、10×Taq酶缓冲液5μL、MgCl2（25mmol/L）3μL、2mmol/LdNTP5μL、引物（15pmol/L）5μL、Taq酶（4U/μL）0.5μL、无菌水补至50μL混匀。于BIO-RAD型扩增仪进行第二轮扩增；反应程序为94℃预变性5min，然后进入30个循环的94℃1min，55℃1min，72℃1.5min，后72℃延伸10min，4℃保温。
　　为避免外源DNA的污染，上述整个单染色体体外扩增过程均在无菌条件下进行，并设立严格不含染色体DNA的阴性（无菌水）对照和以10pg总DNA为模板的阳性对照。
　　非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、固定、银染、显影：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、固定、银染、显影：参照文献8[8].
　　2结果与分析2.1染色体的切割、分离和收集采用SLuCUT-A全自动激光显微切割系统对普通小麦“中国春”和中间偃麦草根尖细胞及花粉母细胞中期染色体进行切割，并对目标染色体切割前、切割后和收集后分别拍照，其中普通小麦“中国标染色体（一个二价体），表明目标染色体未被切割；切割路径，表明目标染色体（一个二价体）已经被切割分离；图1C箭头所示目标染色体（一个二价体）被切割收集后留下的空白处，表明目标染色体（一个二价体）已经被黏性Eppendorf管盖收集。利用SLuCUT-A全自动激光显微切割系统切割植物染色体时，研究者能够清楚地判断所切割的目标染色体是否被切割、分离和收集。
　　2.2切割染色体DNA的DOP-PCR微量扩增及初步检测分离回收到的切割产物能否利用PCR技术进行DNA扩增，是关系到显微切割技术是否具有应用价值的关键问题。本研究分别以收集的普通小麦“中国春”单个细胞、两条染色体、单条染色体、染色体片段和中间偃麦草单条染色体及普通小麦“中国春”基因组DNA、中间偃麦草基因组DNA和无菌水为模板，进行第1轮DOP-PCR微扩增，利用第1轮DOP-PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，部分电泳图谱。
　　由图2可见，在2～6泳道（普通小麦“中国春”
　　微切割染色体）和第7泳道（阳性对照普通小麦“中国春”基因组DNA）均获得较强的弥散扩增信号，其扩增产物长度均大于100bp，而在泳道8（阴性对照无菌水）中未观察到此扩增信号，由此表明，在2～6泳道中所观察到的扩增信号（DNA产物）很可能是源自普通小麦“中国春”基因组DNA；微切割、分离和收集的中间偃麦草染色体DNA经实验也得出相同的结论，说明微切割、分离和收集的中间偃麦草DNA产物很可能是源自中间偃麦草基因组DNA.
　　从扩增信号的强度可以看出，DOP-PCR微量条件不仅适于普通小麦“中国春”和中间偃麦草微量DNA扩增，而且扩增效率较高。
　　2.3切割染色体扩增产物的验证以第1轮DOP-PCR扩增产物为模板，再进行第2轮DOP-PCR微扩增。利用第2轮微扩增产物进行6非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、固定、银染、显影和拍照，其电泳图谱见图3.
　　由图3可见，5（中间偃麦草一条染色体）泳道产生了1条清晰可辨的DNA谱带（箭头所示），此条谱带的分子量大于100bp，小于250bp，而在阴性对照9泳道（无菌水）中却未观察到此条谱带。在1、3、4、6、7泳道（微切割普通小麦“中国春”染色体DNA）和阳性对照8泳道（普通小麦“中国春”基因组DNA）中，均分别产生了两条分子量相同且清晰可辨的DNA谱带（箭头所示），其中1条DNA谱带的分子量大于250bp，小于500bp，另1条DNA谱带的分子量大于100bp，小于250bp，且小于中间偃麦草所产生的那条DNA谱带的分子量，而在阴性对照9泳道（无菌水）中却未观察到这两条DNA谱带，由此说明，所切割和收集的普通小麦“中国春”的染色体DNA与普通小麦“中国春”基因组DNA有同源性。由以上分析表明所切割和收集的普通小麦“中国春”染色体的DNA源自普通小麦“中国春”基因组DNA.并且经玉米、大蒜、奥地利黑麦等多种植物实验表明，采用6非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可以快速有效地验证微切割染色体的来源。
　　3讨论SLuCUT-A全自动激光显微切割系统的载物台的移动、切割路径的任意勾画、切割长度的测量、聚焦、激光能量、切割速度，到拍照、保存、收集等，整个操作过程都是通过简便易用的UVCUT软件来完成，通过鼠标可以随意勾画各种不规则的形状或者利用多种绘图图形来选择切割目标；激光切割的直径小于1微米，激光能量、聚焦和切割速度由软件控制，采用的是冷激光切割，激光不与分离样本直接接触，不会因热效应而对DNA、RNA和蛋白等样本造成降解，并且切割时，是将制备好的染色体标本片子翻放在载物台上，使样本在PEG膜的下面，而黏性的Eppendorf收集管盖在PEG膜的上方，黏附时塑料帽只与膜接触，而不直接与组织接触，收集管盖只黏附分离下来的膜和样本，提取过程不需要激光的轰击，对样本没有损伤，并且污染较轻；所以SLu2CUT-A全自动激光显微切割系统具有操作简单易掌握，切割、回收快速准确，样本不被会被降解，污染轻等优点。但此系统镜检细胞不方便，因为SLu2CUT-A全自动激光显微切割系统是通过移动鼠标来控制载物台上下左右移动，而移动鼠标控制载物台远远不如普通显微镜的旋转螺钮控制载物台上下左右移动方便，因此，利用此系统时，必须先在普通显微镜下把镜检到的理想细胞做好标记，以便切割时查找。
　　单条染色体（或染色体片段）是细胞遗传学及分子生物学精细研究的良好材料。根据不同的

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